微生物法测定维生素B12的方法学评估

微生物法测定维生素B12的方法学评估

在我国，微生物法测定食品中的维生素B12、叶酸、泛酸、烟酸、生物素是首选方法，因此在国民生计中起到重要作用。本文拟以维生素B12为例，从方法学的角度就微生物法的特点，作一文献上的综述。

1954年，微生物法测定乳品中的维生素B12**出现，是由英国国立奶业研究所、维生素B12的研究专家Margaret E. Gregory首先建立，她用该法测定来自不同动物种属的奶中的维生素B12的含量（1）。

微生物法测定乳品和食品中的维生素B12，在上世纪90年代引入我国。关于这一方法，已有多篇报道进行了方法学上的探讨。现总结如下：

（一）对微生物法的评估

上海市食品药品检验所蒋孟虹等人用微生物法测定了肠内营养粉剂中的维生素B12 含量。她们认为，高效液相色谱法仅适用于常量分析,维生素B12对色谱前处理要求高, 因此色谱很难满足痕量测定的要求。但微生物法操作步骤较多, 一些因素可能影响测定结果的准确性。因此，她们对影响因素进行了研究，结果发现：

Ø测试菌液的透光率在60%～80%之间时, 标准曲线的线性拟合较好，过高过低均导致线性拟合差。

Ø当测试菌液的加入量为50μL时, 标准曲线线性拟合良好。过多易导致浊度过高而不成梯度。

Ø标准曲线最高浓度点的透光率在30%左右为**测定时间, 此时各浓度点的透光率差别较大, 可拉开梯度。

Ø维生素B12 在0.001～0.010 ng/mL 浓度范围内线性关系良好。

她们认为，微生物法检出限低、灵敏度高,测定结果准确可靠, 适用于微量维生素B12的含量测定, 值得经常进行维生素检测的实验室应用推广（2）。

国家乳制品质量监督检验中心的张玉杰等人提出：微生物法的好处是，测定的是维生素的生物活性含量，更具生物学意义。同时，微生物作为一种活试剂，具有自身的特异性和高度的灵敏性，使得测定结果更为准确。微生物分析法测定VB12在国际上已有几十年的历史，只是在我国报导还不是很多。

他们采用微生物法对12个奶基婴幼儿食品的VB12含量进行了多次重复测定，发现相对误差均在10%以内，50%的样品测定的误差小于5%，回收率多在90-110%之间。因而该方法是可行的，结果也是准确可靠的（3）。

广东产品质量监督检验研究院林耀文等人发现，微生物法测定含乳饮料中的维生素B12，重复性良好，线性相关系数大于0.99，平均回收率为91.20%～102.2%，检出限为0.04ng/ml，具有简便、快速、灵敏度高、检出限低等优点。（5）

（二）微生物法的干扰因素和注意事项

国家乳制品质量监督检验中心的张玉杰等人提出了几点注意事项：

**，有些细菌可以产生Vb12，因此所有玻璃器皿及用具都要严格清洗，严格灭菌。清洗后**放入250℃烘箱，加热1-2小时。整个分析过程都要注意防止溶液过多地暴露于光线中。

第二，建议每个梯度标准溶液设三个平行检验管，减少误差。所有检验管灭菌后要迅速水冷却，尽量避免颜色形成。冷却速度要一样。

第三，测定菌体浓度时，要等检验管内发育和繁殖过程完全停止后再进行。（3）

湖北省宜昌市产品质量监督检验所陈绪华等人观察了测定培养基的不同品牌对维生素B12线性的影响。发现青岛海博和北京陆桥的维生素B12测定培养基作出的线性结果不理想，主要是培养基所含的本底较高。而更换为BD的测定培养基后，所得的线性结果较理想。本底存在，会导致目标物质的促生长作用减弱（即吸光度没有等量增加）。当测定培养基中不含本底时，菌悬液以及培养时间的微弱变化只影响标准曲线的生长量，不影响曲线的线性。（4）

据我们了解，目前BD的维生素B12测定培养基已停产，因此可选用国际知名的微生物生产商HiMedia的产品。

上海市质量监督检验技术研究院王志伟等人强调，菌种的活力和纯度对实验结果有非常大的影响，应严格按照要求进行菌种纯化（7）。

（三）对标准微生物法的改进

广州市质量监督检测研究院吴环等人提出了几个更简便的操作技巧用于维生素B12的测定：一是试验体系的体积缩小。用1.2ｍlPP小管替代了传统的试管进行标准曲线溶液及样品溶液的培养和测定；标准曲线溶液和样品溶液的制备也在1.2mlPP小管中进行，由此避免了大量玻璃器皿的使用，同时显著降低了外部干扰；二是将试验菌株预先固定在96排管，利用甘油保护冷冻的菌种。具体操作为：将莱士曼氏乳酸杆菌冻干菌株活化后，接种到乳酸杆菌肉汤培养基，（36.0±1.0）℃培养18～24h，将增菌肉汤培养物3000r/min离心数次，弃去上清液，使用含有甘油的维生素B12测定培养基进行适宜的稀释后，将菌悬液加入1.2ｍlPP小管中，-80℃冻存备用。该方法极大地缩短了试验周期，而且菌株活力稳定，保证了试验的有效性。（6）

吴环等人进一步将该方法推广到婴幼儿配方乳粉中的其他3种水溶性维生素（叶酸、生物素、肌醇）的测定，结果同样有效。（8）

上海市质量监督检验技术研究院王志伟等人对于天然燕麦的维生素B12的测定，加入了1%的 α-淀粉酶溶液，发现酶解溶液有助于提取维生素B12，降低样品粘度，更方便测量，因此优于现有的标准方法。

以上探讨虽然大部分是针对维生素B12,但对于采用微生物法测定的其他水溶性维生素如叶酸等也同样有效，可以借鉴。

参考文献：

1) Margaret E. Gregory. The Microbiological Assay of ‘Vitamin B12’in the Milk of Different Animal Species.British Journal of Nutrition, 1954,8(04): 340

2）蒋孟虹、许苹等. 微生物法测定肠内营养粉剂中微量维生素B12 的含量.食品安全质量检测学报. 2016,7(3):893-897

3）张玉杰、吕为群.奶基婴幼儿食品中维生素B12活性测定微生物分析法.生物技术,1993(6):39-43

4）陈绪华、刘健、江一飞. 不同测定培养基对维生素B12线性的影响. 生物技术世界. 2013(4):47

5）林耀文、佘之蕴，李姣等.微生物法测定含乳饮料中维生素B12含量. 饮料工业.2013,16(4):39-42

6）吴环、刘冬虹、张慧、聂炎炎、黄宇峰.微生物法快速检测食品中维生素B12含量的应用研究.中国乳业.2014,(4):42-44

7)王志伟、徐琼、陈欣钦、曲勤凤. 天然燕麦中维生素B12的测定中2种微生物法前处理方式的比较.食品安全质量检测学报, 2017,8(1):275-279

8）刘冬虹，吴环，聂炎炎，黄宇锋. 优化微生物法快速测定婴幼儿配方乳粉中4种水溶性维生素.华南预防医学,2014(6):594-597