维生素B12测定培养基

维生素B12测定用培养基                        

原理

乳酸杆菌生长需要特别的营养，因而在非选择性培养基上很难生长。维生素测定用培养基用于维生素的微生物法测定。该方法需要三种培养基：即维持培养基，用于保持菌种活力；接种培养基，用于测试菌液的制备；测定用培养基，用于待测维生素的定量。

维生素B12测定用培养基，不含维生素B12，但包含所有其他维生素和必要养分，用于莱士曼乳酸杆菌（ATCC 7830）的生长。莱士曼乳酸杆菌（ATCC 7830）作为测定用菌，最早由Capp等人描述（1）并被美国药典和美国分析化学家协会（AOAC）所推荐（2，3）。

用已知稀释度的维生素B12标准品，可以制备标准曲线（2，3）。

测试菌液的制备是将将活化后的菌株接种到乳酸杆菌肉汤培养基中，推荐在37°C 孵育24 小时，再离心、清洗、重悬于10 ml 生理盐水中，再通过浊度分析或酸度分析，确定生长反应。

  用维生素B12的浓度及对应的吸光度制作标准曲线。用标准曲线可确定待测样本中的维生素B12的浓度。

应非常小心地避免培养基和玻璃器具的污染。应使用洁净的无去污剂的玻璃器具。少量的外源物质的污染可能导致错误的结果。

用于接种的测定菌应在专用的培养基中培养。

应用

维生素B12测定用培养基推荐采用莱士曼氏乳酸杆菌（ATCC 7830）作为测定用菌，进行维生素B12的微生物法测定。

培养基组分

成分                                     克/升

无维生素酸水解酪蛋白                 15.000

葡萄糖                               40.000

天门冬酰胺                           0.200

醋酸钠                               20.000

抗坏血酸                             4.000

L-胱氨酸                             0.400

DL-色氨酸                            0.400

硫酸腺嘌呤                           0.020

尿嘧啶                               0.020

黄嘌呤                               0.020

核黄素（维生素B2）                   0.001

盐酸硫胺素                           0.001

生物素                               0.00001

烟酸                                 0.002

对氨基苯甲酸（PABA）                0.002

泛酸钙                               0.001

盐酸吡哆醇                           0.004

盐酸吡哆醛                           0.004

盐酸吡哆胺                           0.0008

叶酸                                 0.0002

磷酸二氢钾                           1.000

磷酸氢二钾                           1.000

硫酸镁                               0.400

氯化钠                               0.020

硫酸亚铁                             0.020

硫酸锰                               0.020

聚山梨酯80                           2.000

盐酸鸟嘌呤                           0.020

最终pH值 (25°C)                     6.1±0.2

质量控制

Ø外观——奶油色至黄色，具均匀性，倾向形成可容易分解成粉末状的软块

Ø制备好的培养基颜色和透明度——淡琥珀色透明溶液，可能有轻微沉淀

Ø配比浓度——在25°C下8.5%w/v(8.5g/100ml水）水溶液，pH值为6.1±0.2

ØpH值——5.90-6.30

配置

称取8.45g干粉培养基溶于100ml蒸馏水，必要时加热使培养基完全溶解。混匀，使轻微的沉淀均匀分布。测定时，分装试管，每管为5ml培养基（包含标准品和待测样品）。加蒸馏水，使总体积达到10ml。高压消毒15磅121°C 5分钟。立即冷却培养基。每个试管(10 ml)的维生素B12水平为0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.2 ng时，均可获得满意结果。

培养反应

进行微生物法测定维生素B12。采用莱士曼氏乳酸杆菌（ATCC 7830），35-37°C孵育18-24小时。

生长状况

随着测定管标准品水平升高，（美国药典维生素B12标准水平，0，0.025,0.050，0.075,0.1,0.125,0.150,0.2ng)，目标菌生长逐渐递增，伴随着620nm处吸光度的增加。

文献

1.  Capps B. E., Hobbs M. H. H. and Fox S. H., 1949, J. Biol. Chem., 178:517.

2. The United States Pharmacopoeia, 2006, USP29/NF24, The United States Pharmacopeial Convention, Rockville, MD.

3.  H. Williams, (Ed.), 2005, Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 19th Ed., AOAC,Washington, D.C