叶酸测定用培养基

叶酸干酪培养基

原理

正常人的血清叶酸水平正常为9.9ng / ml。在身体异常或得病时，叶酸水平会显著变化。叶酸干酪培养基采用干酪乳杆菌（ATCC 7469）为测定用菌，用于叶酸的微生物法测定。该培养基是基于Flynn等人(1)的配方，并经Baker等人(2)和Waters、Mollin(3)改良。用于维生素测定的测定菌通常需要三种培养基：维持培养基、接种培养基和测定用培养基。后者通常是化学限定的培养基，包含所有测定菌生长所需的养分，但不含有待测的分子。类似的，叶酸干酪培养基包含干酪乳杆菌生长所需的所有成分，但不包含叶酸。因而，添加一系列浓度增加的叶酸，会观察到干酪乳杆菌生长反应的递增。

干酪乳杆菌（ATCC 7469）的贮备菌制备是在AOAC推荐的乳杆菌琼脂（货号M366）试管穿刺接种培养，35-37°C孵育18-24小时后，试管储存在冰箱里。每月转接一次。测定菌液的制备是将贮备菌转种到含10ml微量维生素检测接种肉汤（货号M133）或乳酸杆菌肉汤（货号M367）的试管中。35-37°C孵育24小时后，在无菌条件下菌液离心，弃掉上清，再重悬于10ml的无菌叶酸干酪培养基中（货号M543）。再像之前一样沉淀，并清洗一次。最后，清洗后的菌株重悬于10ml叶酸干酪培养基中，并用该培养基进行1:100稀释。1滴重悬液用于接种到每个测定管中。也可用0.85% NaCl代替培养基来清洗和稀释。

由于灭菌条件，孵育温度等因素会影响标准曲线读数，并且每次不会完全一样，因此每次都应制备标准曲线。10ml管内的标准品量为0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1ng。

叶酸标准品的制备：将20mg叶酸干粉溶于含有20ml乙醇的100ml蒸馏水中。用0.1N NaOH调整溶液pH值为10.0，再用0.05N HCl调pH为 7.0。该溶液含有200g叶酸/ml。用999ml蒸馏水稀释1ml该溶液，则浓度为200ng/ml。再用999ml叶酸缓冲液A（货号M544）稀释1ml该溶液，则为0.2ng/ml的叶酸标准溶液。每管取0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0和5ml该溶液，配置即告完成。

血清样本的保存：让血液样本凝固以分离血清。分离血清至干净干燥的血清管，并离心除去存在的任何血细胞。小心操作，避免出现红细胞的溶血。分装血清样本至于干净干燥的试管中，每管5ml。每管加入25mg的抗坏血酸。-20°C以下温度保存。

血清样本的制备：解冻含有抗坏血酸的血清。向5ml样品中加入45ml叶酸缓冲液A（M544）。孵育37℃90分钟。然后15磅121℃高压灭菌2.5分钟。离心去除凝固的蛋白，将上清液转移至清洁干燥的管中。该透明溶液即可用作叶酸待测的样本。

样本叶酸浓度的测定步骤：如前所述使用0.5,1.0,1.5ml或其他体积的制备好的血清提取物。加入5ml叶酸干酪培养基和足量的蒸馏水，使每个试管的总体积为10ml。15磅121°C灭菌5分钟。冷却试管并向每个试管中加入一滴接种液。35-37℃孵育18-24小时后进行浊度读数。读数前将试管冷藏15-30分钟以停止细菌生长。620nm检测吸光度。待测样品中的叶酸含量应根据标准曲线来确定，不过要考虑样品稀释度。

应非常小心，避免培养基和玻璃器具被污染。应使用洁净的无去污剂的玻璃器具。少量的外源物质的污染可能导致错误的结果。

应用

叶酸干酪培养基用于叶酸的微生物法测定。干酪乳杆菌（ATCC 7469）为测定用菌。

培养基组分

成分                                     克/升

无维生素酸水解酪蛋白                 10.000

葡萄糖                               40.000

醋酸钠                               40.000

磷酸氢二钾                           1.000

磷酸二氢钾                           1.000

DL-色氨酸                            0.200

天门冬酰胺                           0.600

抗坏血酸                             4.000

L-胱氨酸盐酸盐                       0.500

硫酸腺嘌呤                           0.010

尿嘧啶                               0.010

黄嘌呤                               0.020

脱水山梨糖醇单油酸酯络合物           0.100

还原型谷胱甘肽                       0.005

硫酸镁                               0.400

氯化钠                               0.020

硫酸亚铁                             0.020

硫酸锰                               0.015

核黄素（维生素B2）                   0.001

对氨基苯甲酸（PABA）                0.002

盐酸吡哆醇                           0.004

盐酸硫胺素                           0.0004

泛酸钙                               0.0008

烟酸                                 0.0008

生物素                               0.00002

最终pH值 (25°C)                     6.7±0.2

质量控制

Ø外观——米黄色至黄色均一自由流动粉末

Ø制备好的培养基颜色和透明度——淡琥珀色透明溶液，可能有轻微沉淀

Ø配比浓度——在25°C下9.4%w/v(8.5g/100ml水）水溶液，pH值为6.7±0.1

ØpH值——6.60-6.80

配置

称取9.4g干粉培养基溶于100ml蒸馏水，加入50mg抗坏血酸。加热至沸腾使培养基完全溶解。测定时，分装至每管为5ml培养基（包含标准品和待测样品）。加蒸馏水，使总体积达到10ml。高压消毒15磅121°C 5分钟。立即冷却。

培养反应

采用干酪乳杆菌（ATCC 7469）进行叶酸的微生物法测定。35-37°C孵育16-18小时。

生长状况

可获得良好的生长。随着测定管叶酸标准品浓度升高（即 0, 0.1,0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1ng），干酪乳杆菌生长逐渐递增，伴随着620nm处吸光度的增加。

文献

1. Flynn, Williams, ODell and Hogan, 1951, Anal. Chem., 23, 180.

2. Baker, Herbert, Frank, Pasher, Hunter, Wasserman and Sobotka, 1959,Clin. Chem., 5, 275.

3. Waters and Mollin, 1961, J. Clin. Path., 14, 335.