96孔板微生物法测定血液中叶酸操作方法

96 孔板微生物学法微量测定叶酸是叶酸测定方法的重大改进, 这使测定时间大为缩短。原来试管法需时 36～48h，现缩短为 16～18h，而且这一方法更为精确、灵敏、简便。 96孔板叶酸测定使用量更微，测试样本量大、重复性好，适用于大批量样本的检测研究。下面介绍一种96孔板法测定血液中叶酸含量的操作方法[1]。

叶酸生长培养基

取4.7 g叶酸培养基加入到 100 mL蒸馏水中煮沸，冷却后加入氯霉素 0.05 g、抗坏血酸0.75 g，每20 mL分装于培养管中，保存于－80℃ 。

菌株

将 1 支冻干乳酸杆菌氯霉素耐药株接种于20 mL叶酸生长培养基充分摇匀后，置于 37℃ 培养箱内培养24 h，取1 mL 接种于另一个20 mL 新鲜生长培基传代培养，得到对数生长期的菌液，与 80% 的甘油等体积混合，每1 mL 分装保存于 -80℃。

检测培养基

称取9.4g  Himedia叶酸测定用培养基（货号：M543）干粉培养基溶于100mL蒸馏水，加入50mg抗坏血酸。加热至沸腾使培养基完全溶解。测定时，分装至每管为5mL培养基（包含标准品和待测样品）。加蒸馏水，使总体积达到10mL。高压消毒15磅121°C 5分钟。立即冷却，临用前加入氯霉素 0.03 g，抗坏血酸 0.75 g和 200μL 菌株。

标准曲线

取 100 μg / L 的叶酸标准液用0.5% 抗坏血酸钠溶液 1∶200 稀释，得到 0.5 μg/L 的标准工作液。在 96孔酶标板中1～12列分别加入标准工作溶液 0 μL、0 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、30 μL、40 μL、50 μL、60 μL、80 μL、100 μL，用0.5% 抗坏血酸钠溶液定容至 100 μL，**列加入10 μL 的叠氮钠溶液( 3% ) 作为空白对照。全板每孔加 150 μL Himedia叶酸测定用培养基，封膜，37℃厌氧培养42 h，采用免疫酶联测定仪测定595 nm下吸光度(A)值。以叶酸浓度为自变量(X)浓度为(0、0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5)μg/L

，以乳酸杆菌生长后培养基 A 值为因变量(Y) 制作标准曲线。

( 5 )测定

将血浆标本用 0.5% 抗坏血酸钠溶液40 倍稀释，分别在 A1，A2，A3 孔加100 μL，在 B1，B2，B3 孔加 50 μL。B 行用 0.5% 抗坏血酸钠溶液定容至 100 μL。A1，A2，B1，B2作为测定孔，A3，B3 孔加 10 μL叠氮钠溶液( 3% ) 作为空白对照孔。每孔分别加入 150 μL Himedia叶酸测定用培养基，培养方法同上。测各样本生长后的吸光度值，由标准曲线换算样品中叶酸含量。

参考文献

[1] 徐文婕，曲全冈，刘建蒙.微生物法检测血浆叶酸实验方法评价及应用. 中国卫生检验杂志[J] 2011 , 7 (21 ): 1722-1724.