Vero 细胞无血清细胞培养基的发展

无血清细胞培养基的发明是培养基发展史的一个里程碑。无血清培养基是向基础培养基中添加血清替代物，既满足动物细胞的营养需求，又能有效避免使用血清而引发的一系列问题，为无血清培养技术的发展奠定了基础。

20世纪80年代后期，具有商业价值的新型无血清培养基纷纷上市。无血清培养基的迅速发展和显著优势，使得无血清培养基在动物细胞工程领域得到了重要的应用。尽管牛血清( FBS) 作为细胞培养基的必需添加因子而广泛使用，它提供细胞在体外培养贴附生长和增殖所必需的营养因子，但近几年来对血清的生产使用存在道德和科学上的诸多争议，并且牛血清的使用存在诸多缺点和风险。经过研究者们的不懈努力，后来摸索出了一些降低或替代血清的策略，研发出了一系列低血清和无血清培养基供动物细胞和组织培养使用，尽可能避免血清的缺点和风险。

在20世纪50年代之前，在动物细胞培养过程中，用纯牛血清来培养动物细胞。50 年代后期，逐渐出现了 RPMI、MEM 等简单的培养基配方，并添加少量的牛血清就能完全满足细胞培养的基本营养需求，因此将血清含量降到了20%。到70年代，各种基础的细胞培养基纷纷上市并广泛应用，培养基中血清的添加含量降到更低，为5%～10% 。

Vander等[1]用激素替代牛血清刺激特定细胞分化生长的工作，开辟了化学界定无血清培养基的发展开端。大多数无血清培养基的配方设计都申请了**，秘而不宣，因此实际应用中使用的是商业化的无血清培养基。

Vero 细胞 (非洲绿猴肾细胞) 是日本学者 Yasumura 和 Kawakita 两人在 1962 年正式从非洲绿猴肾脏分离的，是世界卫生组织(WHO) 和《中国药典》认可的疫苗生产细胞系。使用血清培养宿主细胞较大的风险是向疫苗产品中引入血源性病原生物污染的潜在可能，从而影响疫苗的生产工艺和安全问题。

无血清化学限定培养基的设计和优化是Vero细胞无血清培养技术的关键。现今商业化的Vero细胞无血清的配方设计比较通用的方法是选定一种基础培养基，Vero细胞可选用的培养基有M199、MEM、DMEM等合成培养基。近年来，HiMedia公司生产的SFRE 199系列颇受欢迎，它是在基础培养基M199的基础上改良的，开始用于原代狒狒肾细胞(Bak)的生长和维持。继而国外很快将SFRE 199用于vero细胞的无血清培养，效果颇佳[2]。（下图）。结果显示，NCTC 135和SFRE 199-1培养基1：1混合悬浮培养Vero细胞，同时添加BSA1μg/mL和亚油酸0.1μg/mL，细胞数量快速增长，在第50天至70天时，细胞数量增加到107/ml并保持稳定，而另一种培养基NCTC 135：Waymouth  MB 752/1的培养效果则较差。

NCTC 135培养基（货号：AT227）和SFRE-199-1（AT089）HiMedia均有生产，为干粉包装，有5L，10L，20L或更大规格可选。

SFRE 199对M199的改进主要表现在显著提高了精氨酸-盐酸、半胱氨酸、胱氨酸、L -谷氨酰胺、L -谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、酪氨酸和葡萄糖的浓度，使细胞实现较大的无毒活性。同时添加了丙酮酸钠、硫酸锌、胰岛素、半乳糖等。半乳糖可避免乳酸过度积累，并使pH值在细胞延长的维持期内，保持在生理范围。

SFRE 199分为1型和2型。SFRE 199-1含有Hank盐，SFRE 199-2含有Earle's盐，对CO2的耐受能力不同。二者均不含胰岛素，胰岛素需在使用前单独添加。

参考文献

[1] Vander VJ，Brunner D，De Smet K，et al． Optimization of chemically defined cell culture media-Replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods[J]. Toxicology in Vitro，2010，24(4) : 1053-1063．

[2] Jack Litwin.The growth of Vero cells in suspension as cell-aggregates in serum-free media. State Bacteriology Laboratory, 105 21 Stockholm, Sweden.

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