化学限定细胞培养基的优化

化学限定细胞培养基的优化

——细胞体外培养方法中取代胎牛血清

作者：J. van der Valk, D. Brunner , K. De Smet, Å. Fex Svenningsen, P. Honegger, L. Knudsen, T. Lindl, J. Noraberg, A. Price, M.L. Scarino, G. Gstraunthaler

刊登于Toxicology in Vitro. 2010，24(4): 1053-1063

1. 背景

要使细胞存活更长时间或评估它的增殖、迁移和分化，一个基础培养基肯定是不够的，需要添加一些因子。血清是最常用的细胞维持和增殖的添加成分，特别是胎牛血清。然而，胎牛血清的使用也存争议。一、使胎牛遭受痛苦。二、血清成分的批次波动。三、潜在的污染，如BSE，这使得动物源材料在新型生物药的生产中被强烈排斥。事实上，在20%-50%的商品化FBS中存在病毒阳性。

以无血清培养基应用为主要内容的良好细胞培养实践（Guidelines for Good Cell Culture Practice, GCCP）已发表。ECVAM科学建议委员会（ESAC）也发表了一个声明，强烈建议使用无血清替代物。尽管实施GCCP还没有形成法规，但GCCP已成为GLP和GMP的一部分。

一个工作坊于2003年开始启用，讨论减少细胞和组织培养中FBS使用的可能性。本次会议的报告明确建议，减少或停止未出生的用于生产FBS的牛犊的痛苦。伦理、安全性和科学根据也在会上给出，用于替代细胞和组织培养方法中的FBS。2009年又开了一次工作坊，讨论了无血清培养基的现状。工作坊在丹麦哥本哈根举行，是在欧洲体外毒理学会（ESTIV）、荷兰-比利时体外方法学会（INVITROM）和丹麦体外毒理学网络赞助下组织的。本次工作坊的结果清楚地显示了是可以开发出一些不同原代细胞和组织以及细胞系的无动物成分培养基的。而且，该会还给出了指导意见，用于开发无血清、化学限定的哺乳动物细胞和组织培养基。

2. 无血清培养基的开发

无血清培养基的开发可追溯到1955年。早期尝试是用无血清、激素补充的培养基培养细胞，以了解血清在细胞培养基中的作用，并努力识别血清中所有与细胞增殖有关的生理成分，并用那些成分进行替代。该努力没有成功。从那时起，几种不同无血清制剂的配方已经出来了，培养基补充了大约十个必要成分。其成功率为10-20％。1976年，G.佐藤进行了开创性的工作，开发出一个好的化学限定无血清培养基。他通过添加特定激素来替代血清，能促进细胞生长和分化。在最近10年里，对细胞功能的研究更为深入，已能鉴定出更多成分，加入到无血清培养基中使其性能更佳。许多转化细胞或新转染的细胞系可以成功地在这些无血清培养基中维持生长而无需适应。并且细胞特异的培养基数量还在稳步增长。现在，有超过一百种不同的无血清培养基配方已经开发出来，并且可以购买使用，而无须自己开发。

2.1. 基础培养基

随着时间的推移，很明显几乎每种类型细胞都有自己的营养需求，因此，广谱的细胞无血清培养基几乎不可能。不同类型细胞具有不同受体，参与细胞的生存、生长和分化，并释放不同的因子到环境中去。由于开发新型的无血清培养基门槛较高，下面讨论一些研发策略。

建议开始新配方时，使用DMEM和Ham's F12的50:50（v / v）混合物。该配方结合了DMEM的高氨基酸含量和Ham's F-12的高营养。此外，基础培养基必须含有一种基础成分，即ITS添加剂（胰岛素，转铁蛋白和硒）。胰岛素，从1924年起，已是细胞培养中必不可少的，现在是培养基中最常用的激素。转铁蛋白也是一种培养基中的必需蛋白质，其主要作用是将铁转移到细胞中。硒是一种必需的微量元素，尤其在硒蛋白中起作用，它可以保护细胞免受氧化应激。

2.2. 添加剂

尽管有些细胞类型可以在基础培养基中维持生长，但大多数细胞需要添加剂以存活、增殖或分化。大多数常见的添加成分如下：

2.2.1 激素

所有哺乳动物的激素都是血液循环中的生理成分。因此，它们也以不同的量存在于血清中。 因此，补充激素是开发无血清培养基的**步。胰岛素在所有无血清培养基配方中都是必需的。 其他常用激素有糖皮质激素（地塞米松、氢化可的松）、三碘甲状腺原氨酸（T3）和能升高细胞内cAMP的细胞特异性激素。水溶性甾体激素也可用。

2.2.2 生长因子

通常将生长因子添加到基础培养基中以增加细胞增殖和刺激特定细胞功能。 传统上，生长因子和其他补充剂是以胎牛血清（FBS）的形式添加。大多数生长因子是高度细胞特异性的，其他的则更广谱，可以对几种不同的细胞类型也有阳性效应。FGF-2，例如，对无血清培养的软骨细胞表型有阳性作用。培养的细胞有些可以释放生长因子，刺激自身和其他细胞的增殖。

2.2.3 蛋白酶抑制剂

添加的FBS包含蛋白酶抑制剂，即α1-抗胰蛋白酶和α2-巨球蛋白。蛋白酶抑制剂终止胰蛋白酶的消化，并且通过抑制细胞更新时偶尔释放的溶酶体肽酶而对细胞有益，蛋白酶抑制剂对细胞具有保护作用，但不是必需的。当没有提供蛋白酶抑制剂时，应该仔细评估胰蛋白酶的浓度。

2.2.4蛋白质水解产物

蛋白质水解产物用于提供氨基酸和短肽。这些不是细胞培养中必不可少的成分，其效果有争议。事实上，一些研究报告蛋白水解产物对细胞培养的有益作用，其他一些研究证明蛋白质水解产物不支持细胞生长，而且更高的浓度会减少细胞生长。蛋白质水解产物不是化学限定的成分，在可重复性和实验的可比性上可能存在问题。

2.2.5剪切力保护剂

生物反应器和灌注培养液中的湍流导致细胞的剪切应力。 血清能保护细胞免受

这种剪切力损伤。 Pluronic F68具有类似的效果，但对于普通细胞培养不是必需的。

2.2.6 蛋白质

蛋白质是不同低分子量组分的载体，并且可以促进细胞黏附。 牛血清白蛋白通常用作脂质载体。然而，BSA来自动物，可能受到污染或包含杂质。 如今，可获得重组蛋白，包括白蛋白用于无动物成分的细胞培养。

2.2.7 维生素

维生素由基础培养基提供。至少有7种维生素对细胞生长和增殖至关重要：胆碱，叶酸，烟酰胺，泛酸，吡哆醛，核黄素和硫胺素。B族维生素是细胞生物化学所必需的，并且也存在于DMEM以及Ham F-12中。

2.2.8.氨基酸

培养哺乳动物细胞，至少13种氨基酸是必需的，即Arg，Cys，Gln，

His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Thr，Trp，Tyr，Val）并且在DMEM中以高浓度存在（0.5-4mM）。 7种非必需氨基酸（Ala，Asn，Asp，Glu，Gly，Pro，Ser）是在Ham's F-12中提供。

2.2.9谷氨酰胺

谷氨酰胺是蛋白质和核糖核苷酸合成的必需前体。它也是用于细胞快速分裂和利用葡萄糖不佳的细胞的重要呼吸燃料。然而，谷氨酰胺也有它的缺点：在溶液中不稳定，谷氨酰胺分解和代谢导致对细胞有毒的氨的产生和积累，因为氨不被无血清和/或无蛋白培养基中的血清蛋白所吸附。要克服这些缺点，人们又开发了在培养基中使用谷氨酰胺的替代方案。例如，在表达足量谷氨酰胺合成酶的细胞中，谷氨酸可以代替谷氨酰胺。最近的一项发明是使用含有谷氨酰胺的二肽，即丙氨酰-谷氨酰胺和甘氨酰-谷氨酰胺，商品名为GLUTAMAX™。这些二肽更稳定

和耐热，甚至可以对含有这些物质的培养基进行高压灭菌。二肽被细胞内或细胞外的肽酶裂解，从而释放谷氨酰胺和丙氨酸或甘氨酸。因此，谷氨酰胺的可获得性取决于肽酶活性，这导致较低速率的的谷氨酰胺消耗和氨生产。 GLUTAMAX™可以1：1的摩尔浓度代替谷氨酰胺。

2.2.10微量元素

大多数微量元素都可以在基础培养基中获得。Ham's F-12富含必要的微量元素。

2.2.11 脂类

脂肪酸和脂质在细胞培养中的作用长期以来被忽视。脂质可作为能量储备，作为细胞膜的结构成分，以及在运输和信号传导中扮演角色。 一些脂质可在基础培养基中获得。但是，建议必需脂肪酸和乙醇胺为添加剂。水溶性添加剂可商品化获得。血清白蛋白是脂肪酸和脂质的载体。必需脂肪酸是几种无血清培养基配方的组分。

2.2.12 抗生素

应尽可能避免使用抗生素。可能会产生耐抗生素的微生物，抗生素对细胞生长和功能也可能有不良影响。

2.2.13黏附因子

大多数哺乳动物细胞需要用于细胞粘附的特殊的培养基质才能在体外存活和生长。塑料培养皿，经过特殊处理后在聚苯乙烯表面引入电荷和亲水性，例如多聚L（或D）-赖氨酸或鸟氨酸，是最常用的细胞黏附基质。培养平皿上包被其他基质如细胞外基质成分或胶原蛋白基质，可进一步促进贴壁细胞的黏附。

2.2.14渗透压

尽管哺乳动物细胞表现出对渗透压一定的耐受，渗透压仍应始终仔细检查，并且

在适应新的细胞基配方时，应对渗透压进行补偿。

2.3 开发一种无血清培养基

如上所示，要从细胞和组织培养基中去除FBS，并仍然保持细胞粘附、生长和增殖，很重要的是要包括几种细胞培养基中的组分（需大量）。图中1显示的是一个“培养基金字塔”。金字塔的底部为基础培养基，包括DMEM / Ham's F-12（50：50，v/v），添加有胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）。要使贴壁细胞黏附在培养容器底物，应考虑包被细胞外基质的成分。细胞无血清培养通常需要细胞黏附因子。

培养基配方开发的下一步是添加特定的激素和生长因子。表皮生长因子（EGF）和糖皮质激素（氢化可的松、地塞米松）应在大多数培养基中存在。根据细胞类型，还可能需要额外的细胞特异性生长因子，例如神经元所需的神经生长因子（NGF）。已经证明上皮细胞培养时需要添加升高细胞内cAMP水平激动剂。在这方面，毛喉素和霍乱毒素，尽管是强药剂，被用作体外有丝分裂原。

金字塔顶端代表无血清培养基成分的特异性增加：即添加有脂质，抗氧化剂和/或特定维生素。维甲酸（维生素A）是一些上皮类型细胞所需的添加剂。维生素E（α-生育酚）和抗坏血酸（维生素C）被看作抗氧化剂。其他无血清培养基中的抗氧化剂有β-巯基乙醇（β-ME）和硒（见上文）。

图1. 开发无血清培养基的金字塔

2.4 细胞系对无血清培养基的适应

有如下几种方法：

1. 逐步减少血清用量，直到血清比例为0.1%

2. 含血清培养基与无血清培养基比例的变化

3. 和方法2相似，只不过采用比例逐渐降低的条件培养基

4. 接种的细胞已实现驯化好

3. 促进无血清培养基的开发和应用

3.1 信息来源

在自我开发之前，应先查查数据库，是是否有已经开发好的。市面上现已有450种不同无血清培养基，但只针对有限的细胞类型。

3.2 无血清培养基互动在线数据库

3.3 验证新的培养基和适应的细胞

在关于使用FBS和其他动物源性添加剂的声明中（ESAC，2008），ECVAM科学咨询委员会强烈主张开发新的无血清体外培养方法。此外，如体外使用含血清的培养方法，将培养基提交给ECVAM进行验证，必须提供使用血清的理由。

为了促进无血清培养基的使用，ECVAM（替代方法的欧洲验证中心）将鼓励无血清培养体系验证的提交者公开他们的无血清方案。已有的替代动物成分的培养方法，应同含血清的培养基进行比较，确保观察终点不受影响。

ECVAM网站 (http://ecvam.jrc.ec.europa.eu)有一个关于无血清培养基的公开论坛。

3.4 其他活动

希望优先使用无血清培养基的资助机构可以提供促进FBS替代品的激励措施。关于体外培养和工艺的研讨会和会议，还应鼓励开展特定研讨会和海报，交流与无血清培养基有关的经验。研讨会可以由细胞和组织培养学会（例如ESTIV）的工作组筹备。此外，应开展无血清细胞和组织培养价值的教育，他们也是基础培养技术教育和培训的一部分。

支持协调行动，促进与特定细胞和组织培养相关的信息交流，可以在国家，欧洲和国际层面进行。

4. 无血清研究举例

4.1 血小板裂解物

下面报道了使用人血小板裂解物（PL）作为血清替代物。PL是由保存的人供体血小板浓缩物制备。在低渗盐水中冻融可实现血小板的**活化。血小板颗粒生长因子的释放程度可通过ELISA和Western Blotting测定。PL的生长促进能力和促有丝分裂能力，可在众多有选择的连续细胞系上进行测试，这些细胞系的生长特征、表型和分化终点应已很好地确定。 PL+DMEM支持细胞的生长、增殖和分化，通过穹顶形成评估近端小管样LLC-PK 1（猪肾）和HK-2（人肾）细胞，而远端小管样MDCK（狗肾）细胞在血小板提取物添加的无血清DMEM / Ham-F-12中生长良好。除贴壁上皮细胞系外，不依赖贴壁的Raji人淋巴瘤细胞也进行了研究。 PL完全支持悬浮Raji细胞的生长和增殖。在所有细胞系中，监测增殖是通过确定上皮培养物的细胞密度（每个生长区域的细胞数）来确定，以及刃天青或WST-8测定。生长率和增殖率在含10％FBS或5％PL的培养基条件下，二者相当。为了确定PL的促增殖潜力，细胞外MAPK（ERK1 / 2）的刺激进行了检测。GR激活MAPK信号通路，使下游ERK1/2磷酸化。将PL添加到静止状态的LLC-PK1培养物中，几分钟内即可发生ERK1/2的磷酸化和激活。FBS对应的ERK1/2活化的时程相同。数据显示，在哺乳动物细胞和组织培养中，PL替代FBS是有价值的，具有高潜力。

4.2无血清聚集脑细胞培养物

涉及脑细胞的3D培养，这里略。

4.3器官型脑切片培养和化学限定的无血清培养基 Neurobasal与B27

器官型脑切片培养可以生长数周和数月，保留其基础细胞结构、组成和连接，并越来越多地用作研究神经退行性疾病机理和治疗的模型。在1990年代中期，含25％马血清的Optimem培养基被无血清的Neurobasal和B27添加剂所替代。

细胞起始是在Serum Optimem培养2天，之后即用无血清培养，旨在避免未知生长因子和血清批间差异的影响。含B27的Neurobasal的使用效果很好，直到2000年初发现培养物种的坏死洞。2010年，一个美国小组公布了N21的配方，它是对B27配方的优化。Sigma-Aldrich也在2010年初推出一系列神经元和干细胞的完全培养基，Stemline TM，其中包含了所有必需的添加剂，可和Serum Optimem进行比较。

4.4 化学限定培养基和血清培养基有时诱导细胞采用不同信号转导通路进行增殖

含B27的Neurobasal培养基为化学限定培养基，可长期培养神经元，而成纤维细胞或星型细胞不过度生长。然而，采用该培养基原代培养有时会产生不一致的结果。例如，一些胶质细胞和神经元生长所采用的信号通路，会与在血清培养基中生长不一样。

4.5 人小肠细胞Caco-2在无血清培养基中功能分化所需培养条件的优化

虽然人Caco-2细胞系代表了**和最广泛使用的可吸收肠道细胞模型，该细胞分化功能仍显示出高度的异质性，这主要由于培养流程的不同。胎牛血清（FBS）是产生变异的重要来源。因此多年来已经使用无血清培养基培养这些细胞。Halleux和Schneider于1991年开发出一种用于Caco-2细胞的无血清培养基，它改进自肝细胞的营养培养基，添加有胰岛素，表皮生长因子，白蛋白-亚麻酸，氢化可的松和三碘甲状腺原氨酸（T3）。细胞生长在包被有胶原蛋白的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）滤膜上，作为肠道屏障的模型。并在培养15天后显示出肠细胞的许多分化功能，正确的极化和细胞侧壁通透性的降低，表明建立了有正常功能的紧密连接。不久之后，Jumarie和Malo获得了接种在塑料基质上、采用ITS添加的DMEM培养的分化的Caco-2细胞。该限定培养基可是使细胞3周后正常分化，仅有蔗糖酶活性低于血清培养的细胞，但可加入T3提高其活性。

一种包含ITS和脂质的无血清培养基被用于分化Caco-2细胞。为提高该培养基性能，试验了一些不同的添加剂，（A）胰岛素，转铁蛋白，硒（ITS）和脂质混合物（油酸盐，棕榈酸盐，胆固醇和BSA作为载体）; （B）来自ITS的生长因子和激素的成分限定的混合物。

5.结论

使用血清培养细胞和组织是有问题的，它同时存在有伦理和科学的原因。因而推荐使用无血清培养基，并且**是无动物成分和化学限定的培养基。

因此建议采用"不，除非”的原则，即不使用血清，除非还没开发出无血清培养基。开发无血清培养基，一些成分是必需的哦，另一些则是有用的。而且采用了一些方法使细胞适应新的无血清培养基。

对于新的血清的验证要注意，应使原先研究的标志物在细胞和组织上仍然表达。现在已经有了成功地开发无血清培养基的方法，文中的模型显示，开发并不是一项容易的任务，还存在一些问题。通过数据库、会议和网络写作，广泛的交流有助于开发出新的无血清培养基配方。

附录

开发无血清培养基的建议

1.开发无FBS培养基时，从适当的基础培养基开始。50:50（v/v）DMEM和Ham's F-12和ITS是一些研究成功的选择。

2.当使用谷氨酰胺时，应加入浓度为2-4mM的谷氨酰胺。也对于一些细胞系，也可以添加Glutamax I TM（L-Ala-L-Gln）。

3.必要时补充细胞类型特异性的生长因子，激素，维生素，微量元素和脂质。

4.注意渗透压。

5.对于某些研究或细胞类型，可以添加特定蛋白质。

6.有些必需脂肪酸，不存在于基础培养基中，可能需要添加。

7.**不使用抗生素。

8.对于一些细胞类型和原代培养，可以使用黏附基质。许多无血清配方需要预先包被培养皿。

9.对于生物反应器和灌注培养，可以添加剪切力保护剂（Pluronics F68）。

10.细胞驯化应小心进行。

11.始终检查细胞的性能是否发生了变化，以及研究终点是否受到影响。

12.成功后，与同事和通过现有细胞培养数据库分享你的配方。