【支原体核酸法】用绝对定量标准品

目前，支原体核酸检测法（常规PCR、荧光定量PCR）应用较为广泛，尤其在生物制药和细胞治疗领域，可以替代传统的培养法和DNA染色法。但同时，各种品牌的支原体PCR和qPCR检测试剂盒又良莠不齐，因此，对核酸法本身进行方法学验证是非常必要的。

国际上对支原体核酸法的验证提出了三项要求：检测限、特异性和耐用性。在检测限方面，欧洲药典除了规定要达到10CFU/ml或100CFU/ml外，也指出可以用等量的支原体核酸拷贝数来表示。这时就需要选用合适的支原体核酸标准品。

全球知名的微生物污染防控公司Minerva Biolabs（以下简称德国MB公司），专门提供包括欧洲/日本药典指定9种支原体在内的PCR绝对定量标准品共14种，可进行10倍梯度稀释，制备标准曲线，确定核酸法的检测限，因而广受全球药厂的青睐。

德国MB公司提供的PCR绝对定量标准品信息如下：

德国MB公司提供的PCR绝对定量标准品信息如下：

一、试剂盒组分：

说明：2-8℃保存。使用前，标准品溶解后在-18℃以下保存。避免反复冻融。

、质控保证

微生物在液体培养基中培养，并在对数生长期末期收集。DNA用酚氯仿抽提，继而用过滤柱纯化。DNA纯度用分光光度计法测量，保证OD260/280≥1.8。微生物物种用Sanger测序法确定。

纯化DNA的定量采用小牛胸腺DNA标准品进行光密度测量，进而用荧光法证实。DNA最终稀释，并调整为1×10⁸基因组拷贝/管。稀释倍数用qPCR分析证实。

每个批号的产品均提供质控证明。

三、操作步骤：

1、标准品复溶

（1）所有管短时离心。

（2）加入100μl Tris缓冲液到带绿盖的管中。

（3）室温静置5分钟。

（4）涡旋振荡10秒，再离心5秒。

（5）使用适当体积的DNA溶液直接用于PCR或直接稀释，用于制备DNA标准曲线

2、制备10倍稀释的DNA标准曲线

（1）使标准品和Tris缓冲液室温达到平衡。

（2）标记每个1.5ml离心管。每个管加入90ml Tris缓冲液。

（3）标准品混匀离心。

（4）标准品1：加10μl标准品母液到第1管，盖盖并混匀。简要离心。

（5）标准品2：从第1管中取出10μl到第2管，盖盖并混匀。简要离心。

（6）标准品3：从第2管中取出10μl到第3管，盖盖并混匀。简要离心。

（7）下面的管均重复以上步骤。推荐制备6个标准品（梯度稀释）。

3、PCR扩增

溶解的DNA可直接用于常规PCR。德国MB公司推荐Venor®GeM PCR试剂盒用于支原体检测，或Onar®

Bacteria PCR试剂盒用于细胞培养中的细菌检测。

对于qPCR，使用梯度稀释的DNA标准品，可制备标准曲线。大多数qPCR软件允许通过标准曲线进行定量分析。这依赖于正确的设置，包括标准曲线的参数。为便于正确定量，要确定你的标准曲线样品。使用者可以试用下列参数用于设置。体积决定了每个PCR反应的基因组拷贝数。

4、评估

使用梯度稀释，qPCR检测后Ct值会随着DNA浓度下降而升高。通过Ct值和DNA样本量产生一条标准曲线，未知样本的浓度通过标准曲线可以计算。下列的扩增曲线是用德国MB公司的Venor®

GeM qEP试剂盒绘制的。所用仪器为CFX96 Touch荧光定量PCR仪。

图1. 梯度稀释标准品的扩增曲线。标准品为发酵支原体的10⁶至10个基因组拷贝数。

图2.用Bio-Rad CFX Manager软件产生的标准曲线。

总之，PCR定量标准品可提供低拷贝数的DNA标准品，因而可精准确定核酸法的检测限。而10CFU的灵敏度标准品只能观察是否能达到这一阈值，而无法确定最终为多少。从这个角度说，PCR绝对定量标准品具有自己独特的优势。