支原体标准品在核酸法验证中的应用

支原体核酸法是通过检测支原体的特异核酸序列，以确定细胞上清或生物制品中是否存在支原体污染的一种方法。由于它具有检测时间短（只需3-4h）、操作便捷等特点，越来越受到生物制品企业的青睐。

支原体核酸法包括PCR和qPCR，可作为药典规定的培养法或DNA染色法的替代方法，或与以上方法相互补充。事实上，早在2011年，就有动物疫苗厂家在2011年第5期的《广东农业科学》上，报道了用德国Minerva Biolabs（简称MB）公司的支原体PCR试剂盒，用于检测疫苗中是否存在支原体的污染，它可与培养法互为补充，共同用于生产，为生产提供可靠的数据支持。

但支原体核酸法在用于放行检测之前，需先进行方法验证。欧洲药典和日本药典均要求核酸法需要在灵敏度、特异性和耐用性三个指标方面达到要求。

例如，在灵敏度方面（又称最低检测限），要求核酸法替代培养法，则灵敏度需达到10CFU/ml；核酸法替代DNA染色法，则灵敏度需达到100CFU/ml。

在特异性方面，欧洲药典和日本药典要求，核酸法要识别指定的常见9种支原体，而不识别与支原体有近缘关系的菌属，如丙酮丁醇梭菌、嗜酸乳杆菌和肺炎链球菌，也不识别其他细菌和哺乳动物DNA。

在耐用性方面，欧洲药典要求检测结果不受方法参数的小的偏差的影响，如浓度的变化（MgCl2、引物、dNTP）、提取步骤的细微差别等。实际上这是强调结果的可靠性和稳定性，不受人为操作误差的影响。这可通过3轮不同时间段内的检测来实现，每轮进行8次重复检测，最后观察结果有什么变化。

在进行方法验证时，参比标准品是必不可少的。世界**微生物防控专家德国MB公司提供有一系列的支原体标准品和支原体DNA标准品，用于支原体核酸法的方法学验证。

图. MB公司提供的10CFUTM支原体套装

MB提供的标准品有三类：一类是灵敏度标准品，它同时也用于耐用性验证。该标准品为冻干粉型的灭活支原体，这样不会造成实验室污染。原支原体来自英国NCTC菌种保藏中心，由于传代次数低，也很少发生突变。支原体经标准定量，有10CFU/管和100CFU/管可选。使用时用1ml与待测样本同样的基质液去溶解。之后进行支原体DNA抽提，再进行核酸法检测。如结果阳性，则表明最低检测限能达到上述标准。

MB公司第二类标准品为特异性验证用标准品，它包括支原体基因组DNA以及细菌基因组DNA，种属经测序验证。该标准品为10ng左右包装，为冻干粉型。

第三类标准品是经过严格定量的支原体DNA标准品，每管支原体基因组DNA的量为1×108基因组拷贝，用于10倍梯度稀释制备标准曲线，以对核酸法（主要是qPCR）的检测限进行精确定量，并可验证标准品浓度对数与Ct值的线性关系。

图. 肺炎支原体DNA的定量。模板DNA的范围为2X105-2个拷贝数基因组

值得指出的是，欧洲药典和日本药典均要求先进行支原体DNA抽提，再进行核酸法检测。因此，方法验证实际上包括了核酸法的这两部分。

对于生物制品、细胞治疗产品的生产企业，在选用已经过厂家全面验证的支原体检测试剂盒之外，还需自己按照待测样本类型进行方法的适用性验证。因为试剂盒的验证并不能代替包括操作过程在内的方法的适用性，操作、样本基质和仪器同样会对核酸法的技术指标产生不可忽视的影响。

如您对德国MB公司的支原体标准品或检测试剂盒感兴趣，欢迎联系MB公司中国区总代理上海威正翔禹生物或北京缔一生物科技有限公司。

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德国MB公司简介：

德国MB公司，全称Minerva Biolabs，是世界**的微生物污染控制公司，成立于1999年，总部位于德国柏林。MB公司具有ISO 9001和ISO 13485体系认证。

公司创始人来自于全球闻名的罗伯特•科赫微生物研究所。

二十年来，MB公司专注于微生物污染检测与清除，

特别是支原体和军团菌的技术和产品，在世界上遥遥领先。

Ø自1999年起即研发细胞培养和生物药工业用QC检测试剂

Ø配备生物安全二级实验室

ØGMP级洁净车间生产

Ø世界**的支原体PCR检测试剂供应商

ØIOM和PDA成员

ØISO 9001和ISO 13485认证

注：IOM全称Institute of Medicine

PDA全称Parenteral Drug Association

2007年，上海威正翔禹生物科技有限公司作为MB公司的全国总代理，将支原体检测防控的优秀产品引入中国。十几年来，不断为中国生物研究实验室，以及众多生物制药企业，提供了完整高效的支原体等微生物检测及祛除解决方案。