支原体检测 常见答疑

问：在用qEP做支原体检测的时候，加入内控对照品，在仪器设置上是需要选择两个通道吗？

答：是需要2个通道，一个FAM, 一个HEX，HEX是对应内控的通道。

问：我想问一下，7500仪器里面没有HEX这个通道选项，可以用哪个通道代替呢？

答：7500这款是没有HEX荧光标识，不过问过厂家，说7500有VIC，可以用VIC通道。

问：qPCR结果判定中，FAM positive，HEX irrelevant中这个不相关是具体指什么？

答：这个不相关是指如果FAM是阳性，那么由于扩增时存在竞争性抑制，所以内控是否有扩增，其无关紧要。

问：在用样品制备试剂盒时，进行支原体DNA提取时，加入内控对照品，实际上是监控在提取操作总是否能够binding支原体DNA，而无法监测这步操作的回收率的，是吗？

答：“实际上是监控在提取操作总是否能够binding支原体DNA”，可以这么理解，或者说是在监测整个提取过程。我们又问了一下厂家，内控和样品的提取效率是一样的，这样可以反映样品的真实情况，因为只要内控提取后能测出来，那就表明提取是没有问题的。极少量的支原体如10CFU的，通过提取，也是可以检测到的，表明灵敏度是没有问题的。样本Ct值和10CFU的Ct值比较，是可以进行相对定量的。

问：你们好，我问一下你们这个Venor Gem qEP试剂盒能做放行检测吗?

答：放行应相当于国外说的release testing, 这个qEP试剂盒是符合国外药典规定的性能，能做放行检测的。同时需注意要做支原体DNA抽提才行，抽提是用另外一个盒子，见厂家的venor gem sample preparation kit。

问：这个如果是用来检测细胞上清，是不是就不用提取DNA了呢？

答：只要是跟药典有关，跟临床治疗或制药检验有关，就需要提取DNA。如果仅仅是科研用培养细胞，筛查支原体，则可以不提。

问：询问qPCR仪器的设置

答：具体可见MB厂家文件Venor^®GeM qEP: Cyclers Programming，可从网站上下载。

问：被动参比染料是选“none”吧？

答：对，没有ROX，选none

问：大家好，想咨询一下，咱们支原体DNA提取时所取的样本量是依据什么定的呢，比如，我们有CAR-T细胞，病毒液等，如果CAR-T细胞按细胞数来的话取多少细胞数比较好，或者如果病毒液按体积的话多少体积更佳呢？

答：支原体 DNA 提取试剂盒可从最多含有 1X 10⁶细胞/ml 的细胞上清中直接分离 DNA，病毒没有要求。总体积最多 200μl。提取的样本就是细胞上清，ATMPs（高级医用药品），细胞培养基等。病毒液应该也是最初来自细胞上清吧。样本量是根据支原体污染量得出的经验值，跟核酸纯化柱上的DNA膜吸附能力有关。

问：病毒液就是类似细胞上清的。如果体积大于200ul的话我们可以浓缩，但是这个体积有没有一个上限呢？

答：体积有上限，是200 to 1000 µl, 可以参看经典法试剂盒的那个说明书里对样本处理那一块。这个样本量同时还考虑了灵敏度，使检测达到**的灵敏度。如果细胞数高于1X 10⁶细胞/ml ，那必须要先调细胞数了。或者减少样本体积，总细胞数不超，也行。

问：您好，我这边要提取10cfu对照品的基因组，10cfu对照品的说明书写着用1ml基质重悬，基因提取试剂盒说一次上样200μl进行提取，想问您一下，用200μl基质重悬10cfu可以吗，想一次提完。

答：还是建议用1ml的基质重悬，因为灵敏度是以10CFU/ml为单位的。如果用200ul，浓度就高了。厂家建议10CFU标准品复溶了以后，要立即用完，不要再保存，担心可能降解。

问：那1ml溶解的标准品，按提取试剂盒的要求，就得用多个管子一次提完对吧？

答：是的。

问：这个抽提试剂盒的收率有多少，是磁珠还是吸附柱？吸附柱的收率**能有，因为以前我们用其他品牌的抽提试剂盒，收率只有百分之六，这样的话，就存在假阴性结果的可能。

答：是吸附柱的方法。提取试剂盒的COA里，用的是很少量的支原体10CFU/ml，提取DNA后都可以检测到。厂家来信说，产率依赖于DNA的类型（如GC含量，是基因组还是质粒）、操作者的技巧以及样本基质的情况。因为这些情况，操作者很难达到生产商所给的比率，从而形成各种讨论，因此产率没写到说明书里。

问：要检测支原体的培养基中有酚红，是否还需要抽提？

答：只要是在25ulPCR体系中加入的样本量≤2ul，酚红就不会对qPCR构成问题。更高浓度的酚红会引起基线偏移，造成灵敏度降低。如果仅仅是筛查，则不需要抽提DNA。如果是做10CFU/ml的产品放行检查，则需要抽提了。细胞基质的验证总是要做的。

问：做qPCR，一个阴性对照Ct约为40，也有扩增曲线。是什么原因？

答：Ct值大于40可能是由于产生非特异性信号（如primer artefacts）以及极微小的污染所致。 但是，该结果是不具有可重复性的，因此结果仍然是阴性。

问：一步法的盒子的灵敏度是否总低于经典法试剂盒？有没有可能一步法的盒子也能检测10CFU？

答：厂家回复如下：意思是一步法的样本量为2ul用于支原体筛查，经典法为10ul，用于产品的放行检测。检测10CFU的标准品非常具有挑战性。一步法因为样本量不够，很难达到10CFU/ml。如果客户想要包含DNA聚合酶的PCR试剂盒，可以选择VenorGeM Classic G型试剂盒。它和经典法（不含酶）的交叉验证确实做过，显示同样的灵敏度。但全套的验证没有做过。

问：支原体10cfu标准品是干粉吧？ 配完后是多少体积？

答：是冻干粉，加基质液后是1ML体积。

问：基质液产品里带吗？

答：这个产品里不带，是客户自己要检测哪类样品，就用样品里的基质液（例如用的哪个培养基）

问：PCR经典法，跑胶时体现1条阳性带，是否代表PCR经典法可以检测多种支原体，无法区分支原体种类。

答：PCR经典法，跑胶时为1条阳性带，无法区分支原体种类，需要将扩增产物测序鉴定。

问： 支原体标准品一管可以用几次？

答：1管可以用4次，厂家原文是actually you will get 4x 200 ul out of one vial. The kit consists of 3 vials. Replicates of 8 tests are usually required for a validation. So 2 tubes are needed and 1 is for safety.

问：qEP的阳性对照一个25次的盒子里大概可以做几次？

答：这个阳性对照是绿盖管，复溶是加300ul水。如果是科研，每次用2ul。制药是每次用10ul，这样分别是做150次和30次。但是大包装的qEP的阳性对照仍然只是1管或2管。

问：10CFU标准品，验证实验中用量，即验证实验时需多少有效数据？

答：10CFU标准品，使用时需要用1ml你的样本基质（如培养基）溶解，然后需要提取支原体DNA，以保证最高灵敏度（推荐MB公司的支原体DNA提取试剂盒）。每个DNA纯化柱需要样本量是200ul，产出是50ul。每个qPCR反应需要加DNA样本量是10ul。MB厂家推荐1个样本是8个复孔。一般灵敏度与耐用性（Robust）是在一起验证的，也就是说，要前后做3轮独立试验，每次每个样本建议是8个复孔，这样计算下来，2管10CFU标准品是够用了，这也正是10CFU标准品现在的包装。说明：为保证结果可靠性，还需要同时做阴性对照。

问：qPCR法，是否需要分别用不同种类DNA定量标准品分别做标曲，来检测同一个样本，那引物探针是否是根据不同种类支原体而不同。

答：qPCR法，如要定量，先需确定是测定哪种支原体，再用该支原体DNA标准品做标曲。引物探针都是用的MB公司的同一mix，它可识别多种支原体物种。

问：一管DNA定量标准品稀释后能用多久，如何保存。

答：一管DNA定量标准品稀释后在-18℃以下保存。避免反复冻融。保存时间和标签上的效期一样。

问：如何设置阈值线？ 据我所知，基线通常是循环3到循环15的值。阈值线是基线标准差的10倍。这正确吗？

答：设置阈值的一种好方法是将其置于阳性对照扩增曲线的线性区域的中间（如果以对数坐标显示）。

问：内控对照的曲线和样品扩增曲线是否共享同一阈值线？

回答：是的。

问：是否每次做支原体DNA抽提时都要设阴性对照？

答：不需要。只有灵敏度标准品抽提时才需要设阴性对照，以避免外源干扰。