进口支原体参比标准品及应用

以PCR为代表的核酸扩增技术（简称NAT）自1988年发明以来，已广泛应用于科研和临床，但用于生物制药则较晚，这是因为标准化的建立需要一定的时间。

我国药典2020版《前言》指出：

要“紧跟国际前沿，不断扩大成熟检测技术在药品质量控制中的推广和应用，检测方法的灵敏度、专属性、适用性和可靠性显著提升，药品质量控制手段得到进一步加强。如新增聚合酶链式反应（PCR) 法、DNA 测序技术指导原则等，推进分子生物学检测技术在中药饮片、动物组织来源材料、生物制品起始材料、微生物污染溯源鉴定中的应用。”

在支原体检查方面，药典2020版在《通则3301 支原体检查法》中也指出，

除了培养法和指示细胞培养法（DNA染色法），“也可采用经国家药品检定机枸认可的其他方法。”实际上这里的其他方法，就包括分子生物学方法（如NAT）。

2018年6月发布的《CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》指出：

“由于药典支原体检查时间较长，因此也鼓励研究者开发快速的支原体检查法用于中间过程监测或放行检测，但在临床试验过程中必须对快速方法进行充分的验证，验证方法可参考中国药典的相关规定及国际要求，证明所用快速方法的最低检出限至少不能低于药典方法。即使选用商品化的检测试剂，在使用前也需确认其最低检出限不低药典方法。在早期使用时，应与药典方法平行进行，在获得充分的比对数据后才有可能替代药典方法。”        即规定了建立支原体快速检查方法的一般原则。

2018年8月，我国药品监管部门还在《支原体检查的核酸检测方法及方法学验证的思考》一文（见《中国药事》第 8期）中，讨论了方法验证和标准支原体菌株的应用：

“开展支原体NAT方法学最低检出限验证需要2个关键元素的支持：

1）需要有正确鉴定的不同种类的支原体菌株，……；

2）这些菌株需要经过标化，即将支原体菌株制备分装后，通过准确的支原体菌落计数或基因拷贝数定量对验证用的支原体菌株样本进行标化。

目前，国际上有相关机构可提供这样标定好的支原体菌株。”

就笔者所知，德国MB公司

（全称Minerva Biolabs）即提供有这样标定好的支原体菌株和支原体基因组DNA（拷贝数已经标定）。

德国MB公司成立于1999年，总部位于德国柏林。

公司创始人来自于全球闻名的罗伯特•科赫微生物研究所。

MB公司自1999年起即研发细胞培养和生物药工业用QC检测试剂。

他们配备有生物安全二级实验室和GMP级洁净车间生产车间，具有ISO 9001和ISO 13485认证。

在国际上，欧洲药典2007年版即提到支原体NAT法可替代药典方法，但需要进行验证，并提到使用参比标准品。美国药典和日本药典也先后承认可使用验证后的NAT法。

事实上，德国MB公司提供的支原体PCR和qPCR经典法试剂盒已经过MB公司自己的全面验证，如使用MB公司的试剂盒，只需要再做样本基质适用性的验证。在验证中，检测限的验证是主要内容之一。

欧洲药典指出，核酸扩增法如替代药典规定的培养法，其检测限需达到10CFU/ml，如替代指示细胞培养法，检测限需达到100CFU/ml。也可通过核酸拷贝数确定检测限，但应提前建立CFU与核酸拷贝数之间的换算关系。

德国MB公司即提供有标定过的10CFU/管和100CFU/管的支原体菌株。

菌株均来自英国菌种保藏中心（NCTC），具有ATCC编号。

为避免给实验室带来污染，支原体已经过灭活，并且为冻干粉形式，性能稳定。

MB公司提供的支原体菌株有：

莱氏无胆甾原体（A. laidlawii）

发酵支原体（M.fermentans）

猪鼻支原体（M. hyorhinis）

口腔支原体（M. oral）

精氨酸支原体（M. arginini）

肺炎支原体（M. pneumonia）

鸡毒支原体（M. gallisepticum）

滑液支原体（M. synoviae）

螺原体（Spiroplasma citri）

唾液支原体（M. salivarium）

每种支原体灵敏度标准品都提供有CFU与GC（基因组拷贝数）的换算数值（每个批次均不同，详见质控证书）。

表：MB公司提供的欧洲药典要求检测的10CFU™支原体灭活菌株

德国MB公司还提供有经过精准定量的支原体基因组DNA，

每管1×108拷贝数，梯度稀释后可用于确定检测限，制定标准曲线。

图. 肺炎支原体DNA定量标准品梯度稀释后的扩增曲线。

DNA的量为2X105——2个拷贝。

MB公司还提供有用于特异性验证的支原体基因组DNA以及细菌基因组DNA。

另需注意：按照国外药典，支原体菌株和样品需经支原体DNA抽提后，才能进行PCR检测。因此，选择合适的支原体DNA提取试剂盒也是需要考虑的因素。

事实上，我国药典对标准品和参考品均有严格的界定。（见《中国药典·生物制品国家标准物质制备和标定》）这里所说的参比标准品，系迻译自欧洲药典的叫法。或可称之为支原体参比物质样本。

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