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内毒素对细胞的危害到底有多大?

2021-10-26 09:18来源:威正翔禹|缔一生物

我们常说,细胞培养过程中,在选购血清的时候,一定要看检测报告,关注上面一些很重要的指标。比如病毒、内毒素这些。


不难理解,血清中如果有病毒存在,不仅细胞养不好,实验人员的安全也会受到威胁


微信图片_20211026091926.jpg

那这血清中内毒素的高低对细胞培养会有啥影响啊?为什么选血清要选内毒素含量低的呢?


微信图片_20211026091950.jpg


所以今天我们就来聊聊,细胞培养中血清的内毒素问题。



内毒素是个啥?


内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分,叫做脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏后才释放出来,所以叫做内毒素

人体对细菌内毒素极为敏感。


极微量(1-5ng/kg,而1ng≈2.5EU)内毒素就能引起体温上升,发热反应持续约4小时后逐渐消退。


自然感染时,因革兰氏阴性菌不断生长繁殖,同时伴有陆续死亡、释出内毒素,故发热反应将持续至体内病原菌完全消灭为止。


微信图片_20211026092012.jpg


内毒素引起发热反应的原因是内毒素作用于体内的巨噬细胞、中性粒细胞等,使之产生IL-1、IL-6和TNF-α等细胞因子,这些细胞因子作用于宿主下丘脑的体温调节中枢,促使体温升高发热

由于内毒素是细菌死亡裂解或自溶引起的,因此环境中大量存在内毒素。但是如果在细胞培养过程中,出现了大量内毒素,可不是一件好事



内毒素对细胞有啥影响?


此前,有人做过实验,来观察内毒素对细胞培养的影响,记录的影响包括:刺激白细胞培养物产生组织因子、激活鼠巨噬细胞,以及通过极低水平(低于 1 ng/mL)的内毒素抑制鼠类红细胞集落形成等一系列指标。


随后,发表了许多关于内毒素对体外细胞功能和生长影响的论文。


细胞种类

浓度(ng/mL)

内毒素的效应

马巨噬细胞

0.5

诱导产生 IL-6

人体外受精胚胎细胞

1

体外受精成功率降低了 3-4 倍

主动脉内皮细胞

10

硫酸肝素蛋白聚糖出现剂量依赖性改变

鼠 B 淋巴瘤

10

免疫球蛋白轻链的产量增加 30-40 倍

重组CHO细胞

10

改变蛋白质生产

心肌细胞

10

诱发收缩功能障碍

人T细胞

100

在单核细胞存在下诱导增殖和淋巴因子产生

尿道上皮细胞

5000

改变克隆效率


Morris等人发现(1),只需暴露 6 小时,低至 0.5 ng/mL 的内毒素水平可以显着增加马腹膜巨噬细胞中IL-6的产生。Mattern等人发现(2), 100 ng/mL 内毒素可以刺激人类 T 细胞的增殖及其淋巴因子的产生,但这种刺激需要与先前暴露于内毒素的单核细胞直接物理接触。Sibley等人报道,10 到 200 ng/mL 内毒素刺激鼠 B 细胞肿瘤细胞系 (70Z/3) 完成 IgM 的产生,然后在细胞表面表达(3)。


基于上述证据,很明显,内毒素对每种细胞的影响是不一样。接下来我们就看看产生这些影响的机制有哪些。



内毒素对细胞有啥影响?


关于内毒素与细胞培养物相互作用的机制仍有很多未知(4,5,6,7)。



  有一些研究报道:


  • 在血清中发现了一种 60 kDa 的糖蛋白 LPS 结合蛋白 (LBP),它通过脂质 A 结构域与 LPS 结合,大大增强了与免疫系统细胞相互作用的能力。这种增强似乎需要特定的 55 kDa 糖蛋白受体来辅助配合。这种蛋白可以膜锚定再多种免疫细胞上,当与 LPS-LBP 结合时,会启动一系列事件,导致细胞因子 mRNA 的产生和随后细胞释放多种细胞因子,但细胞内信号传导究竟是如何发生的尚不完全清楚。


  • LPS 也可能通过其他方式与细胞相互作用。一些缺乏 CD14 受体的细胞已被证明可以受到 LPS 的影响。LPS 可能通过未知受体、内吞作用或直接进入细胞膜进入细胞 (16)。Risco 等人(8) 证明 LPS 可以与细胞骨架微管结合,并在高浓度下抑制微管聚合。这种结合是LPS 的某些细胞毒性作用的一种可能机制,但作用似乎不涉及细胞因子激活。



参考文献:

1、Morris,D.D., Crowe, N., Moore, J.N.and Moldawer, L.L. Endotoxin-Induced Production ofInterleukin 6 by Equine Peritoneal Macrophages In Vitro. Am. J. Vet. Res.53:1298-1301 (1992).

2、Mattern, T.,Thanhauser, A., Reiling, N.,Toellner, K., Duchrow, M., Kusumoto, S.,Rietschel,E.T., Ernst, M., Brade, H.,Flad, H.D. and Ulmer, A.J. Endotoxin and Lipid A StimulateProliferation of Human T Cells In the Presence of Autologous Monocytes. J.Immunol. 153:2996-3004(1994).

3、Sibley, C.H.,Terry, A. and Raetz, C.R.H.Induction of K Light Chain Synthesis in 70Z/3 BLymphoma Cells by Chemically Defined Lipid A Precursors. J. Biol. Chem.263:5098-5103 (1988).

4、Morrison, D.C.,Dinarello, C.A., Munford,R.S., Natanson, C., Danner, R., Pollack,M., Spitzer,J.J., Ulevitch, R.J., Vogel,S.N., and McSweegan, E. Current Status of BacterialEndotoxins. ASM News,60:479-484 (1994).

5、Raetz, C.R.H.Biochemistry of Endotoxins.Annu. Rev. Biochem. 59:129-170 (1990).

6、Raetz,C.R.H. Bacterial Endotoxins:Extraordinary Lipids that Activate EucaryoticSignal Transduction. J. Bact.175:5745-5753 (1993).

7.、Raetz,C.R., Ulevitch, R.J., Wright, S.D.,Sibley, C.H., Ding, A., and Nathan, C.F. Gram-negativeEndotoxin: An Extraordinary Lipid with Profound Effects on Eukaryotic SignalTransduction. FASEB J. 5:2652-2660 (1991).

8、Risco, C.,Dominguez, J.E., Bosch, M.A.,and Carrascosa, J.L. Biochemical and

ElectronMicroscopy Analysis of the Endotoxin Binding to Microtubules in vitro. Mol.Cell. Biochem. 121:67-74(1993).


从现有的研究可以看出,内毒素对于细胞培养影响还是很大的:


改变细胞外形

活化细胞,产生讯息传递物质

抑制酶活性

抑制人工受精的成功率等


内毒素过高,有事甚至会直接改变我们的实验结果。所以要尽量避免内毒素的干扰。


一般来说,细胞或组织培养过程中内毒素污染源通常来自于血清、培养液及外加药物配制用水等。


所以选择内毒素含量低的血清就显得尤为重要。


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