支原体常规检测方法汇总（四）

大家晚上好！

不知不觉

细胞培养过程中支原体检测内容

已经更新到第四期了

回顾一下知识点

今天我们就来介绍最后两种常见检测法

ELISA法和PCR法

废话不多说

我们直接上干货

首先我们先来简单了解一下ELISA：

支原体检测过程中用到的ELISA，一般采用的是夹心法，针对支原体16S rRNA基因的带标记探针或抗体，来检测培养物中是否含有支原体。

先用纯化过的支原体抗体包被微孔板，制成固相抗体。

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往微孔板中依次加入支原体（Mycoplasmal），再与 HRP（一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物）标记的支原体抗体结合，形成抗体 -抗原-酶标抗体复合物。

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经过彻底洗涤后加底物 TMB显色。TMB在 HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成黄色。

最后用酶标仪分析结果：

颜色的深浅和样品中的支原体（ Mycoplasmal）呈正相关。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度（ OD值），通过标准曲线计算样品中支原体浓度。整个过程时间比较短，一般三四个小时就能出结果。

整个过程除取样外，还包括标准品稀释、加样、温育、配液、洗涤、加酶、温育、洗涤、显色、终止、结果分析，步骤比较多，且很多步骤都需要有一定经验的人操作才能保证准确性，因此对技术要求比较高。

另外，由于依赖抗体的特性，该方法能够检测的支原体种类比较有限，对于没有抗体的支原体，ELISA就无能为力了。

以Venor®Gem OneStep支原体常规PCR检测试剂盒为例，简单介绍一下实验流程。

样本处理

与qPCR类似

取适量待检测样品上清

95℃孵育10min

以对样品进行稳定化处理

试剂制备

离心➡按比例混合➡静置➡混匀

PCR体系建立

设置好阴性对照、阳性对照、重复孔

扣紧盖子混匀

启动PCR反应

根据使用说明设置好程序

电泳结果分析

191bp为内控对照条带，表明PCR反应正常。

当样本存在支原体污染时，由于内控对照与支原体DNA存在竞争，内控对照条带变弱（例如支原体DNA＞1000拷贝）。

阳性对照中支原体DNA＞10000拷贝，内控对照条带会完全消失。

可能在80-90bp存在引物自退火形成的条带，此条带不影响检测结果。

如果待测样本对PCR产生抑制，则内控对照条带变弱（和阴性对照相比），此时应先进行DNA抽提（推荐使用：Venor® Gem Sample Preparation Kit 支原体DNA抽提试剂盒），然后再检测。

常规PCR的优点就是检测时间短：2-3小时即可出结果、灵敏度高、特异性强、操作简单。

缺点也很明显，用PCR检测已经进行过支原体灭活的样品时，由于支原体DNA依然存在，所以此时PCR结果仍为阳性，说明该样品曾经感染过支原体。

另外不同厂家的试剂盒差异比较大，需要谨慎选择。

至此，几种常规的检测方法都已经介绍给大家啦，给大家做了个小总结，供参考。有些单一的检测方法并不严谨，需要结合实验情况，联合使用多种方法进行检验，确保结果的可信度。

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