细胞培养中的污染监控与检测——支原体

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三、支原体污染

支原体概述：

支原体（mycoplasma）是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器、可用人工培养基培养增殖的最小原核细胞型微生物，大小为0.1～0.3微米。由于能形成丝状与分枝形状，故称为支原体。

在细胞培养过程中，显微镜很难捕捉到它们的身影，与细胞竞争营养，影响细胞生长，最终导致实验出现偏差。

支原体污染症状：

在往期文章中，有介绍过如何鉴定支原体污染的，戳戳下方链接一起回顾

DIY判断细胞的支原体污染

支原体实验室检测方法大PK

支原体常规检测方法汇总（一）

支原体常规检测方法汇总（二）

支原体常规检测方法汇总（三）

支原体常规检测方法汇总（四）

总结一下：

支原体污染鉴定：

推荐使用稳定可靠的支原体检测试剂盒，这里以经典法试剂盒：Venor®Gem qEP（货号：11-9025/11-9100/11-9250）为例：

1、样品制备：

①浓缩：当细胞长至90%时，即可收集上清开始检测，可对样品进行适当浓缩。

注：浓缩仅适用于支原体的完整性，避免浓缩前支原体被破坏（如热灭活）。

②稳定：细胞培养样品可能含有丰富的DNA酶，在低温下也能降解支原体DNA。因而推荐进行样品稳定化处理。如果立即进行DNA抽提，则忽略这一步。

③DNA 抽提：大量证据表明，DNA抽提可实现最高的灵敏度。DNA抽提有多种方法，但应适合支原体基因组。

我们推荐：

Venor®GeM Sample Preparation kits （货号56-1010/-1050/-1200) 适合手动DNA抽提。

这些DNA抽提试剂盒已经过大量验证，具体流程参见试剂盒说明书。另外Venor®GeM qEP kit包含的内控DNA对照，也用于验证DNA抽提步骤（内控原理：已知浓度的细胞，包含内部控制DNA序列，该序列不和现有的任何有机体序列同源，对检测的DNA样品干扰极小。在DNA提取前，将该内控细胞和样品一起加入细胞裂解液中，被一起提取出来。和靶点样品一起进行荧光定量PCR实验，内控DNA序列的成功扩增提示靶点DNA的提取成功）。

二、试剂制备与PCR

注：具体参数设置可点击阅读原文，登录缔一官方网站进行查询

另外，下列仪器已经通过PCR反应验证：

3、结果分析

FAM通道检测支原体荧光信号。依据DNA标准曲线和Ct值定量。具体步骤需参考具体qPCR 仪及软件的功能。我们推荐对包括对照在内的每个样品的扩增曲线进行评估。

Ct＜40为阳性结果。Ct≥40为阴性结果。支原体DNA和内控DNA存在信号的竞争性抑制。支原体DNA越多，FAM通道信号越高，检测内控对照的HEX通道信号越低。

今天的文章到这里就结束啦，了解更多商品详情可以点击文末的阅读原文，浏览官方网站~