保姆级细胞冻存方法

冻

存

细

胞

培

养

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。

利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。

既可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，又起到了细胞保种的作用。

在不附加任何保护剂下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH 改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。

因此，冻存时，应向培养液中加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞。贮存在液氮中能减少冰晶的形成。

实验开始前，要先做好准备工作：

将冻存管、离心管、移液管、移液器等耗材准备齐全，放入超净台中，打开紫外线照射 30 分钟。打开通风机通风 3 分钟。用 75%酒精擦拭操作台和双手。准备好冰盒。

将离心机调节至所需转速，细胞完全培养基、DMSO、胰酶等放于37℃水浴箱中预热。

冻存步骤：

1、取出细胞，酒精消毒，放入超净台。

Tip1：应在细胞生长良好、致密度约为 80-90％，活力达 90%以上的状态下冻存。细胞活力差的细胞在冻存后的成活率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存。

2、配置细胞冻存液：按无血清培养基：血清 ：DMSO=7:2:1 的比例配置细胞冻存液。

Tip2：DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色，可以用 0.22 微米滤膜过滤，或者直接购买无菌产品。以 5-10 ml 小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。

Tip3：因DMSO 本身就有灭菌的作用，因此使用前不需要进行高压灭菌。高压灭菌反而会破坏它的分子结构，以至于降低冷冻保存效果。

Tip4：在常温下，DMSO 对人体有害，应注意生物安全防护。

Tip5：冻存液应该提前配制，防止临时配制产生的热量损伤细胞。

Tip6：加大冻存液中血清的比例对于保存某些脆弱的干细胞以及一些比较珍贵的细胞很有好处的。

3、按照细胞传代步骤，对细胞进行消化、解离。

4、消化好的细胞离心后，弃掉上清液，用冻存液重悬。

Tip7：用移液器吸去上清液时，不要吸到底部的细胞沉淀。

Tip8：用移液器轻柔吹打细胞，避免损伤细胞。

Tip9：混匀 DMSO 要快，因为 DMSO 对细胞有毒性，混合后应尽快冻存。

5、可用细胞计数板或计数仪器对细胞进行计数，将细胞总数调节至细胞数量为5×10⁵个/ml为宜。

6、将细胞冻存悬液分装入细胞冻存管中，一般2ml冻存管装入 1 -1.5 ml细胞冻存悬液为宜。

7、放入专业的细胞冻存盒中，或者按照：

﹣4 ℃ 30 分钟→20 ℃ 30 分钟→﹣80 ℃过夜→液氮保存的顺序进行冻存。

Tip10：复苏遵循快速解冻的原则，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。而细胞冻存则要缓慢冷冻，目的是使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶从而降低对细胞的伤害。

对于大多数细胞来说，每分钟降 1-3℃是合适的。

刚刚有提到，在细胞冻存过程中，适当提高血清的比例，更有利于提高对脆弱细胞的保护。

血清不仅提供营养上的支持，作为细胞生长的媒介之一，其品质优劣，直接影响细胞的长势，从而影响实验结果的产出。

因此，挑选一款品质优异的血清尤为重要。Ausbian进口特级胎牛血清，采自5-8个月胎龄牛胚胎中的胎血，出厂前均经过严格质控，并附详细《检测报告》，如pH值、渗透压、内毒素、病毒检测、促细胞生长能力、无菌等检查，均有详细说明。

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